水葫芦(Echhornia crassipes Sloms)又称凤眼莲或凤眼蓝，原产于南美的多年生水生植物，属于雨久花科，凤眼莲属。60年代被引入我国后，由于其繁殖很快，在我国很多地方尤其长江以南迅速蔓延(洪春来等, 2005)。水葫芦的疯长，会破坏水体生态平衡，但适量的水葫芦可以用来高效地去除富营养化水体中的氮和磷，吸收污染水体中各种重金属及其它有毒化合物，所以水葫芦已被用于富营养化的湖泊(濮培民, 1993)和河道(孙文浩等, 1989)、工业废水(de Casabianca et al., 1995)及养殖废水(袁桂良和刘鹰, 2001)等的修复处理。

在高等植物氮同化过程中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一个关键酶，它在ATP存在下，催化氨与谷氨酸(Glu)合成谷氨酰胺(Gln)，而谷氨酸合成酶(glutamate synthetase, GOGAT)则催化谷Gln与α-酮戊二酸生成两分子Glu，Gln和Glu是植物体内各种含氮生物大分子物质合成时氮素的主要供体(韩娜等, 2004; 丁邦琴和李铁军, 2013)。所以，GS是高等植物氮代谢过程中的关键酶，与植物的产量和品质(Fuentes et al., 2001)、植物对氮素的吸收利用效率(Sun et al., 2005)以及植物的抗逆性(Rana et al., 2008)都密切相关。

水葫芦的快速生长与其能高效利用水体中的氮素密切相关。水体中的无机氮有铵态和硝态两种形式，应对水体中不同浓度的铵态氮和硝态氮以及不同的外在环境条件如光照等，水葫芦在生理上会产生相应的适应性改变(李卫国和王建波, 2007)。本研究探讨了光照和不同形式的氮素对水葫芦谷氨酰胺合成酶活性的影响，研究结果为揭示外来植物水葫芦快速入侵的机理提供理论基础，为进一步开发和利用水葫芦进行水体修复提供理论依据。

1结果与分析

1.1不同氮素条件下水葫芦根部的GS活性

不同氮素形态下水葫芦根部的GS活性如图1所示。在清水处理下，处理2 h时和4 h时的GS活性，与处理前相比略低，但无显著差异，处理6 h时GS活性比处理前显著性高。在氯化铵处理下，处理2 h时和4 h时的GS活性都比处理前GS显著降低，处理6 h 时GS活性恢复到处理前水平。在硝酸钾处理下，随着处理时间，GS活性先显著减少，然后恢复，最后又显著减少。以上说明硝酸钾和氯化铵都可以抑制GS活性，硝酸钾的抑制作用比氯化铵更快速。

1.2不同氮素条件下水葫芦叶的GS活性

不同氮素条件下水葫芦叶部的GS活性如图2所示。在清水处理下，处理2 h时、4 h时和6 h时与处理前GS活性没有显著差异。在氯化铵处理下，处理2 h时，GS活性明显高于处理前，处理4 h和6 h后酶活又恢复到处理前的水平。在硝酸钾处理下，酶活与处理前相比没有显著变化，但处理2 h和6 h的酶活与处理4 h的酶活有显著差异，只在处理4 h时，GS活性略高于处理前，但无显著差异。以上说明了氯化铵和硝酸钾都能促进水葫芦叶中的谷氨酰胺酶活性，氯化铵有比较显著的促进作用。

1.3不同光照条件下水葫芦根部GS活性

不同光照条件下水葫芦根部GS活性如图3所示。随着光照强度的增加及光照时间的增加，谷氨酰胺合成酶活性的抑制作用越来越明显。3 200 Lx的光强下，作用1~3 d，谷氨酰胺酶活性虽有减少，但不明显，数据无显著差异，4 800 Lx的光强下，作用1 d，酶活没显著差异，但作用2 d和3 d，酶活性都显著降低。6 400 Lx的光强下，作用1~3 d，酶活性都显著降低。

1.4不同光照条件下水葫芦叶部GS活性

不同光照条件下水葫芦叶部GS活性如图4所示。虽然经过光照培养后，酶活性有稍许增加，但变化不显著，没有明显的统计学意义。

2讨论

高等植物中，氨最初同化作用是通过GS/GOGAT循环发生的，这个循环在植物氮代谢中无机氮转化为有机氮中起着中心作用。外源的无机氮如果是硝态氮，则必须先通过硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR)把NO₃^-还原为NH₄⁺，因此在这一过程中的GS、GOGAT、NR和NiR等起着非常重要的作用(Santos and Salema, 1992)。

外源氮对高等植物谷氨酰胺合成酶的影响因植物种类、组织器官、环境的差异以及氮源的不同而有别(李泽松等, 2000)。多数研究证实了铵态氮和硝态氮均能促进高等植物根部和叶片谷氨酰胺合成酶活性(Mäck and Tischner, 1990; Ota et al., 1990; 黄勤妮等, 1995; Raab and Terry, 1995; 李泽松等, 2000; 张宏纪等, 2001; 胡润芳等, 2012)，但不同形式的氮源对不同种类的植物促进的程度有所不同，黄勤妮等(1995)的研究证实了当以NH₄⁺作为唯一氮源时，小麦幼苗根部谷氨酰胺合成酶和叶胞质谷氨酰胺合成酶活性要比以NO₃^-作为唯一氮源时高。以萝卜叶为材料的实验说明，以5 mmol/L NH₄⁺和1 mmol/L NO₃^-为氮源(5:1混合)比单以NH₄⁺作为氮源显示出高得多的GS活性(Ota et al., 1990)。胡润芳等(2012)的研究证实了铵态氮和硝态氮均能促使大豆的功能叶片中谷氨酰胺合成酶的活性提高，铵态氮增高低蛋白大豆品种GS活性效果较好，混合态氮增加高蛋白大豆品种GS活性效果较好。Mäck和Tischner (1990)的研究表明,铵态氮对甜菜主根及侧根的GS活性增加尤为突出。Raab和Terry (1995)发现糖甜菜块根和叶片中的GS活性，在铵态氮作用下比硝态氮作用下分别提高3.5倍与1.7倍。张宏纪等(2001)的实验同样证实了铵态氮对促进水培甜菜块根GS活性的效果要明显好于硝态氮。我们的实验也证实了硝态氮和铵态氮均能促进水葫芦叶中谷氨酰胺合成酶活性，且铵态氮的效果更好些。这主要是由于NO₃^-需要经过亚硝酸还原酶和硝酸还原酶的作用还原为NH₄⁺后，才能在GS作用在参与到无机氮转化为有机氮的过程中，因此NO₃^-的同化需要消耗更多的能量(Kyaing et al., 2011)。但我们的实验却发现硝态氮和铵态氮对水葫芦根部谷氨酰胺合成酶活性有抑制作用。这点与上述甜菜块根的研究结果是相反的。这可能与植物不同种类有关，甜菜的块根具有积累作用，在块根组织中可以积累较多的蛋白和糖类，因此氮素能够促进根部GS的活性，而水葫芦是一种水生植物，在水生环境中，高浓度铵可能使植物根部产生铵盐毒害症状，而抑制了根部的GS活性，这点与Tischner和Lorenzen (1980)报道的小球藻的GS活性被铵态氮和硝态氮抑制的结果是一致的。但水葫芦在富营养化水体中具有比较强的适应能力，因此，这种抑制作用随时间延长逐渐减弱，到6小时后，GS活性恢复到处理前的水平。李卫国等(2008)报道，水葫芦长时间处于混合态氮的富营养化水体中，根部GS活性反而会得到促进。混合态氮一方面减弱单一铵的毒害作用，另一方面长时间的作用能使植物酶活产生适应性改变。

氮代谢与碳代谢之间是相互关联的，GS不仅在氮代谢中起着关键的作用，也在蛋白质和氨基酸的合成与分解以及植物的呼吸作用之间起着重要的纽带作用(李德红等, 1998)。此外，由于硝酸还原酶是光诱导酶，光照强度的增加能提高硝酸还原酶活性，间接地增强GS的活性。植物体内GS存在多个同工酶，一般认为叶绿体GS随光照强度增加而增强，而胞质GS活性不随光照强度改变而变化(Magalhaes and Huber, 1991)。刘晓明等(2008)的实验证实了光照能增强番茄叶中GS活性。彭进等(2001)的研究证实了水稻非光合组织如根中GS的活性受到光照影响，但不是光照强度，推测可能是由于某些光谱相互作用所产生的未知因素造成的。我们的实验发现水葫芦根部GS活性随光照强度和光照时间的增加而被抑制，水葫芦叶中的GS活性不受光照强度的影响，这点与以往报道的植物不大一样。是否水葫芦体内存在某些GS，其活性或其表达受光抑制，使根部显现出GS活性受光抑制，叶部由于叶绿体GS受光照促进，因此叶部总的GS活性不受光照强度的影响。这点假设仍需要进一步深入研究。

3材料与方法

3.1实验材料

实验中所用水葫芦均采自广州市大学城广东工业大学校区西区池塘。

3. 2试剂

蛋白含量检测试剂盒和谷氨酰胺合成酶试剂盒，购自南京建成生物工程研究。

预培养液：0.25 mmol/L Ca(NO₃)₂.4H₂O，0.25 mmol/L KNO₃，0.1 mmol/L MgSO₄.7H₂O，0.05 mmol/L KH₂PO₄。

提取缓冲液：0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，内含2 mmol/L Mg²⁺，2 mmol/L DTT，0.4 mol/L蔗糖。

3.3方法

3.3.1预培养

采来的水葫芦用自来水清洗根部，自来水培养3 d后，换用预培养液培养15 d，3 d换一次培养液。培养条件：28℃、自然光照。

3.3.2不同条件下培养

3.3.2.1不同氮素条件下培养

预培养后，分别转移到含1.8 mmol/L NH₄Cl、1.8 mmol/L KNO₃和蒸馏水中培养，培养条件：28℃、自然光照。转移后分别在培养0 h、2 h、4 h、6 h后取根或茎样本2 g，用于测定。

3.3.2.2不同光照条件下培养

预培养后，分成3组，继续在预培养液中培养，光照培养条件分别为：3 200 Lx、4 800 Lx和6 400 Lx，光照周期16/8 h，培养温度28℃。分别在培养0 d、1 d、2 d、3 d后取根或茎样本2 g，用于测定。

3.3.3样品处理 

2 g根或叶中加入5 mL预冷的提取缓冲液，冰浴中匀浆，匀浆液静置30 min后，用两层纱布过滤匀浆液，收集滤液，加入提取缓冲液定容至10 mL，12 000×g离心20 min。取上清液作为粗酶提取液。上述提取过程均于4℃下进行。

3.3.4活性测定

用考马斯亮蓝染色的方法测定提取液的蛋白质浓度，利用谷氨酰胺合成酶能够催化羟胺和谷氨酰胺生成T-谷氨酰氧肟酸和氧，再通过显色反应定量谷氨酰氧肟酸，从而得出谷氨酰胺合成酶活性。

3.3.5数据处理

每个反应重复3次，实验结果按平均值±标准差记录。各组数据均值之间的差异显著性用SPSS 13.0中的单因素方差分析中的S-N-K分析，p<0.05时存在显著性差异。

作者贡献

傅明辉完成实验的设计、数据的处理及论文的整体构思和撰写；陈肖丽和严国花完成全部实验过程，文献的查阅及下载。全体作者均为论文的成稿贡献了时间和精力。

致谢

本研究得到国家自然科学基金(21177029)的资助，实验过程得到了广东工业大学2014届本科生高原、赖小勤等的帮助，在此表示感谢！

参考文献

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